Criblage de Macroarray

Pour le criblage de banques spottées sur macroarray, vous devrez fournir au choix :

• Un produit PCR purifié de la séquence recherchée, d'une concentration minimum de 50 ng/µL
• Les oligonucléotides et l'ADN génomique permettant d’amplifier la séquence d’intérêt au CNRGV (et conditions PCR correspondantes)
• Un plasmide contenant la séquence d’ADNc recherchée

Pour le marquage des sondes nous procédons de la manière suivante :

• Les produits de PCR sont marqués par incorporation d'alpha-P33-dCTP selon la méthode de random priming.
• Les oligonucléotides sont marqués à l’extémité 5’ terminale par des gamma-P33-dATP: méthode 5’ labelling kinase.

Chaque sonde est ensuite purifiée sur colonne Sephadex. Après hybridation, les macroarrays sont exposés 2 jours et révélés à l’aide d’un PhosphoImager.

Analyse des résultats qualitatifs

Nous identifions les clones positifs grâce au logiciel High Denstity Filter Reader version 3. Ce logiciel appose une grille sur les images obtenues, détecte la quantité de pixels par unité de surface et enfin détermine les coordonnées des clones contenant la séquence d’intérêt selon le pattern de dépôt.

Chaque clone repéré est enfin validé par PCR.

Equipement Criblage macroarray

Les filtres haute densité sont hybridés par un fragment d’ADN marqué au Phosphore 33.

Le signal radioactif émis par les filtres haute-densité est lu au moyen d’un Phosphoimager.